-Protocol-

Fluorescence in situ hybridization for nuclear DNA in paraffin embedded materials

A．前処理
　　❶キシレンで脱パラフィンし，エタノールに置換した後，風乾する．
　　❷ 0.2 N 塩酸に反応（室温，20 分）する．
　　❸蒸留水に浸透（室温，3 分）する．
　　❹ 2×SSC に浸透（室温，3 分）する．
　　❺ 0.1 M チオシアン酸ナトリウムで熱処理（80°C，30 ～ 180 分）する．
　　❻蒸留水に浸透（室温，1 分）する．
　　❼ 2×SSC に浸透（室温，5 分，2 回）する．
　　❽ 0.1% ペプシンにて酵素処理（37°C，60 分）する．
　　　（この反応は酵素濃度を0.05% ～ 0.2%，反応時間を10 分～ 180 分の間で最適条件を
　　　　検討する．）
　　❾ 2×SSC に浸透（室温，5 分，2 回）する．
　　　　10 10% 緩衝ホルマリンにて後固定（室温，5 分）する．
　　　　11 2×SSC に浸透（室温，5 分，2 回）する．
　　　　12風乾
　　　　13変性液70% ホルムアミド／2×SSC に浸透（73±2°C，5 分）する．
　　　　14 70%，85%，100% のエタノールで脱水（室温，各1 分）後，風乾する．

B．ハイブリダイゼーション
　　❶ハイブリダイゼーション液を加熱（75°C，5 分）し，プローブDNA を単鎖化する．
　　❷ 45°C のホットプレート上にプレパラートを置き，ハイブリダイゼーション溶液を載せる．
　　❸カバーガラスをかけ，周囲をペーパーボンドで封をする．
　　❹遮光した湿潤箱に入れ反応（37°C，12 時間以上）させる．

C．洗浄
　　❶ペーバーボンドとカバーガラスを剥がす．
　　　（カバーガラスは0.3% NP-40／2 × SSC に室温で5 分浸すと剥がしやすい．）
　　❷ 0.3% NP-40／2×SSC で洗浄（72±2°C，2 分）する．
　　❸ 2×SSC で洗浄（室温，5 分）する．

D．対比染色・封入
　　❶ DAPI（1000 ng/ml）等のDNA 染色蛍光色素と蛍光褪色防止剤が含まれた封入剤で
　　　　封入する．
　　❷透明なマニキュアで周囲を塗り封をする．